microRNA(miRNA)是一类短小的非编码RNA分子,通常由20 ~ 24个核苷酸组成。它们通过干扰靶基因的转录或翻译来调控基因表达。这种调控方式在细胞生物学、发育生物学和疾病发生发展等方面都具有重要意义。已经有许多miRNA被证实其异常表达与糖尿病、心血管疾病和癌症等疾病相关。因此,miRNA可作为特异性生物标志物参与疾病的诊断、预后与监测。
迄今为止,已经报道了许多检测miRNA的生物传感器。但由于miRNA在细胞和体液内的丰度较低,生物传感器往往需要与信号扩增策略相结合。其繁琐的步骤和非可视化的结果限制了miRNA生物传感器的广泛使用,也影响了miRNA生物传感器在实际样本中的应用。
针对这一问题,吉林大学电子科学与工程学院董彪教授、口腔医学院王林教授、物理学院李亮教授课题组合作,在国际化学权威杂志Biosensors and Bioelectronics上发表了以“Aversatile upconversion-based multimode lateral flow platform for rapid andultrasensitive detection of microRNA towards health monitoring”为题的相关工作。该研究针对miRNA的检测开发了一种侧流免疫传感器,能够同时产生比色、荧光以及拉曼信号。无需额外的信号扩增方式,传感器可以在20分钟内检测到miRNA,其检测下限为1 fM。且该传感器能够应用在实际血清及唾液样本中,并成功区分患者和健康对照组。
图1 用于检测microRNA的多模侧流免疫生物传感器示意图及材料合成路线
在这项工作中,研究团队开发了一种基于上转换纳米颗粒(UCNPs,NaYF₄: Yb³⁺,Er³⁺)的侧流免疫传感器。该传感器能够同时产生比色、荧光及拉曼信号。其系统原理及结构图如图1所示。将上转换纳米颗粒在试纸条T线上单层修饰,荧光信号的灵敏度得到了保证。
当待测样品中含有目标miRNA时,结合垫上含有拉曼报告分子的金属纳米颗粒Au-DTNB@Ag与miRNA特异性结合。然后该复合体被T线上的核酸探针捕获形成三明治结构。由于Au-DTNB@Ag在T线上的大量聚集,比色及拉曼信号增强,而荧光信号被猝灭。因此,这种基于上转换纳米颗粒的多模侧流免疫传感器实现了对miRNA的特异性检测。
上转换纳米颗粒的表征及信号增强策略如图2所示。该传感器荧光信号的低检测下限主要来源于试纸条的纤维素结构。纤维素复杂的多孔状结构不仅可以在单位面积下容纳更多的荧光纳米颗粒,同时上转换纳米颗粒的单层修饰保证了供体与受体的充分接触。当试纸条干燥时,其内部纤维素结构坍塌,进一步增进了供受体之间的距离,增加了灵敏度。此外,修饰在T线的荧光纳米颗粒减小了试纸条的孔径,同样也使试纸条的灵敏度增加(图2e ~ 2f)。
图2 上转换纳米颗粒的形态结构、表征和性能
以miRNA-21为模版,研究人员对试纸条的检测性能进行了考察,反应时间为20 min。随着待测miRNA浓度的增加。试纸条的三种信号发生了变化。肉眼检出限为10 pM,比色、荧光及拉曼检测范围分别为2 nM ~ 1 pM、1 nM ~ 1 fM和1 nM ~ 1 pM(图3)。
图3 侧流免疫传感器的应用性能评估
另外,为了减少使用步骤,量化使用条件,研究人员设计了荧光-拉曼双检测光路用来同时进行荧光-拉曼信号的检测(图4a)。在该光路下进行检测,试纸条稳定性、特异性均能得到保证(图4b ~ 4f)。试纸条还可用于实际样本检测。在interwetten与威廉的赔率体系 体液样本(图4g)、真实唾液和血清样本中均检测到了信号的变化。可通过miRNA-155明确区分牙周炎患者和正常人(图4h),并通过miRNA-21区分肺癌患者和正常人(图4i)。其结果与RT-qPCR结果一致。
图4 生物传感器的应用性能评估和实际应用
综上所述,本研究介绍了一种检测体液中microRNA的多模侧流免疫生物传感器。通过在试纸条上组装上转换纳米颗粒和核壳纳米颗粒Au-DTNB@Ag,该传感器可以同时产生荧光、比色和拉曼信号。将上转换纳米颗粒单层修饰在条带上极大地增加了荧光检测的灵敏度。使用 microRNA-21 作为分析物模型,该传感器的检测范围在2nM ~ 1fM。
另外,该传感器能够应用在人工和真实体液样本中。利用荧光-拉曼双信号检测光路,该系统可在20分钟内同时对多个信号进行定量检测,为检测体液中的miRNA提供了一种灵活的方法,也为侧流免疫传感器的开发提供了参考。
审核编辑:刘清
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原文标题:基于上转换纳米颗粒的侧流免疫平台,用于超灵敏检测miRNA
文章出处:【微信号:Micro-Fluidics,微信公众号:微流控】欢迎添加关注!文章转载请注明出处。
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