磁珠的构成、吸附DNA的原理

磁珠的构成

一般磁珠由三层构成，最里面是聚苯乙烯，外面包裹一层磁性物质四氧化三铁，最外面再包一层官能基团修饰的高分子材料，上面偶联不同的官能团。不同功能的磁珠，偶联的官能团不同，纯化核酸用的一般是羧基（-COOH）。

磁珠结构示意图

当然不仅磁珠应用在核酸制备上，在化学发光、细胞分选、蛋白纯化等应用磁珠依然是大显身手，是因为不同的官能基团，或者偶联其他，如蛋白抗体等。

磁珠吸附DNA的原理

NGS上用的最多还是贝克曼的XP磁珠。这种羧化磁珠比羟基磁珠产量更高，非特异性结合更少。(Solid-phase reversible immobilization，SPRI）：

（1）反应体系中，较高浓度的 PEG 和 NaCl 导致 DNA 分子水化层脱去，DNA胶体热力学稳定性破坏，构象也随之改变，DNA分子发生聚集沉淀，带负电荷的磷酸基团大量暴漏在外面；

（2）带电荷的磷酸基团通过 Na^+^与羧基形成“离子桥”，使得 DNA 被特异吸附到带羧基的磁珠表面。（该过程是可逆的，在适当条件下，结合的 DNA 分子可以被洗脱回收）

DNA吸附原理图

纯化磁珠进行 “片段分选” 的原理

磁珠双选很大程度依赖于PEG：PEG作为一种分子拥挤试剂，达到一定的浓度时，夺取了一定的水，溶液环境变化，会使较大DNA的结构变紧凑，发生坍塌性的转变而凝聚。不同长度的DNA构象稳定性不同，在遵循热力学规律的情况下，溶液环境与分子拥挤试剂的浓度有很大的关系。即在特定的溶液中，当PEG浓度达到某一临界值时，就会发现一定大小以上的DNA分子构象非连续的发生凝聚。

（1） DNA越长 ：表面裸露出来带负电的磷酸基团越多，整条分子带的负电就更强，更容易吸附到磁珠，只需要较低浓度的PEG和NaCl，就可以回收（需要加入的磁珠体积更小）。

（2） DNA越短 ：就需要更高浓度的PEG和NaCl，将其表面的水化层破坏得更彻底，裸露出来足够多带负电的磷酸基团，才能被磁珠吸附住，从而回收回来（需要加入的磁珠体积更大）。

磁珠纯化图

此外，体系中的PEG还可以增加溶液的粘稠度，让磁珠保持悬浮不容易沉聚，在DNA binding过程中更充分与DNA接触，同时PEG也不易造成蛋白变性和非特异性吸附。但是PEG的DNA沉聚效果容易收到pH、温度等的影响，温度过低PEG也不易与水完全互溶，所以磁珠一般都要求室温平衡后再用，其储存buffer里也会加一些低浓度的pH稳定剂，如Tris-HCl等。

酒精清洗及DNA洗脱

酒精清洗 ：第一，DNA在这个浓度的酒精里溶解度很低；第二，DNA这个时候是聚集状态，磁珠刚好提供一个聚集的奇点，让DNA沉聚在其周围，所以绝大部分DNA不会掉下来。但酒精浓度很重要，一般都要求新鲜配制。浓度太低，盐离子可以清洗得更干净，但是体系中过多的水会将部分DNA从磁珠上溶解下来，造成DNA损失，DNA的回收率可能会收到影响。浓度越高，体系中水越少，清洗盐离子的能力减弱，可能会使盐离子清洗不干净，但DNA的溶解度小，回收率高；

DNA洗脱 ：酒精清理后，先需要晾干磁珠上残留的酒精，以防影响下游实验。（注意晾干时磁珠表面无光泽即可，过度干燥，体系失水过多，会导致磁珠DNA进一步聚集，最终DNA很难回溶到水中，影响回收率）晾干后加入水或者TE buffer，这时体系中已经没有钠离子和PEG，无法形成电桥结构，带负电的DNA和磁珠之间相排斥，水重新包裹DNA形成水化层，使其从磁珠上洗脱下来，溶解到溶液中。