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天下武功唯快不破,引物纯化快未必行。为了控制实验进度,我们总会希望可以更快的拿到订购的引物,但质量和时间却是鱼和熊掌不可兼得,切勿因心急选了假的PAGE纯化。 1引物纯化选择 引物纯化方式的选择不仅决定了合成引物的质量,同时也带来了交付周期上的差异。目前引物的纯化方式基本分为DSL(脱盐)级别、PAGE级别及HPLC纯化,其中HPLC纯化的质量最好,相应的周期也最长。除非对引物要求特别高的如修饰引物、诊断引物等会选择HPLC纯化,其余更多的会选择PAGE纯化及DSL(脱盐)纯化。合成引物时,如果选择DSL纯化,基本可以做到隔夜交付,但对于PAGE纯化却是不行。 为什么PAGE纯化的引物周期不能像DSL纯化的周期一样短呢?我们不妨从不同纯化方式的原理和处理流程来一窥究竟。 2纯化原理和处理流程差异 DSL(脱盐): 又称为简易反相柱,氨盐可以被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱,能有效的去除盐分,纯度可满足大多分子生物学实验需求,但不能有效去除比目的片段略短的引物小片段。 DSL纯化简化流程: 合成→ 过柱纯化(脱盐)→ 定量→ 发货。 PAGE纯化法: 完成DSL纯化后,使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在一定电场强度下,由于迁移速率不一样,引物按长度在PAGE胶中进行分离,分离后切胶回收,胶块浸泡在NaCl溶液中,引物将从胶块中渗透出来,再进行纯化去除回收过程中的钠盐。该方法可以去除合成中的短链引物,纯化效果(特别是长链)很好,可以直观看见质控环节。当然,PAGE纯化也存在一些局限,比如实验步骤多、费人工以及样品损失量大等。 PAGE纯化简化流程: 合成→ 过柱纯化 (脱盐)→ 跑胶分离(3-4h)→ 回收(5-6h)→ 纯化(1h) → 定量→ 发货 从以上流程可以看出,PAGE纯化比DSL纯化至少多用1天的时间。如果缩短电泳时间,引物在凝胶中的分离程度会受影响,从而降低引物回收的质量。 3总结 引物质量对实验的成功起着至关重要的作用,而这很大程度上与所选择的纯化方式密切相关。不同纯化方式的原理和处理流程,一方面决定了引物的交付质量,另一方面也限定了所需要的处理周期。在我们的科研工作中,需要依据研究的质量要求和项目进度情况选择相应的纯化方式。基因编辑:https://www.genewiz.com.cn/Public/Services/GE |
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